分光光度計介紹

簡介

分光光度法是在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性或定量分析。常用的波長范圍為：(1)200～380nm的紫外光區，(2)380～780nm的可見光區，(3)2.5～25μm（按波數計為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計（或比色計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準確度，所有儀器應按照國家計量檢定規程或本附錄規定，定期進行校正檢定。

儀器組成

分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。

光譜范圍

包括波長范圍為400~760 nm的可見光區和波長范圍為200～400 nm的紫外光區。不同的光源都有其*的發射光譜,因此可采用不同的發光體作為儀器的光源。

鎢燈的發射光譜:鎢燈光源所發出的400～760nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙，黃綠，藍靛，紫組成的連續色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源。

氫燈（或氘燈）的發射光譜:氫燈能發出185～400 nm波長的光譜可作為紫外光光度計的光源。

物質的吸收光譜：

如果在光源和棱鏡之間放上某種物質的溶液,此時在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜，它出現了幾條暗線,即光源發射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜。

不同物質的吸收光譜是不同的.因此根據吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質。

當光線通過某種物質的溶液時透過的光的強度減弱，因為有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光被組成此溶液的物質所吸收只有一部分光可透過溶液。

入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過光

如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射，分散等因素造成的入射光的損失則：

入射光 = 吸收光 + 透過光

原理

分光光度計采用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系如下式：

A=-lg(I/I₀)=-lgT=kLc

式中 :A 為吸光度；

I₀為入射的單色光強度；

I 為透射的單色光強度；

T 為物質的透射率；

k 為摩爾吸收系數；

L 為被分析物質的光程，即比色皿的邊長；

c 為物質的濃度；

物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用標準品或對照品同時操作。

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